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YF®555 Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒（橙红色荧光）货号: C6044S/C6044M/C6044L 规格: 2-20T/10-100T/50-500T

YF^®555 Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒（橙红色荧光）

产品货号: C6044S/C6044M/C6044L

产品规格: 2-20T/10-100T/50-500T

目录价（元）:191/550/1100

推荐仪器：荧光显微镜、流式细胞仪

大包装询价

产品概述：

产品货号及规格：

货号	产品名称	规格
C6043S	YF^®488 Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒（绿色荧光）	2-20T
C6043M		10-100T
C6043L		50-500T
C6044S	YF^®555 Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒（橙红色荧光）	2-20T
C6044M		10-100T
C6044L		50-500T
C6045S	YF^®594 Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒（红色荧光）	2-20T
C6045M		10-100T
C6045L		50-500T
C6046S	YF^®647A Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒（远红荧光）	2-20T
C6046M		10-100T
C6046L		50-500T

产品内容：

规格组分	2-20T	10-100T	50-500T	开封后保存温度	稳定性
A. 10 mM EdU	40 µL	200 µL	1 mL	-20℃	开封后按指定温度保存可有效放置一年
B. YF^®488/555/594/647A Azide	10 µL	50 µL	250 µL	-20℃，避光
C. 10× Click-iT EdU反应缓冲液	200 µL	1 mL	5 mL	2-8℃
D. CuSO₄	100 µL	500 µL	2× 1.25 mL	2-8℃
E. Click-iT EdU缓冲液添加物	6 mg	30 mg	150 mg	2-8℃
F. Hoechst 33342	5 µL	25 µL	125 µL	2-8℃

规格：如果用于荧光显微镜检测，所能使用次数为上述各个规格的最大使用次数（针对96孔板培养的细胞），如C6043S可检测20个孔的样品（不同容器的具体用量可参考附表1）；如果用于流式检测，所能使用次数为上述各个规格的最小使用次数，如C6043S可检测2个样品。

荧光光谱数据：YF^®488 Azide：495/519 nm；YF^®555 Azide：555/565 nm；YF^®594 Azide：590/617 nm

YF^®647A Azide：650/670 nm；Hoechst 33342：350/461 nm（bound to DNA）

储存条件
-20℃避光保存，有效期见外包装。开封后，保存温度详见说明书。
产品介绍

细胞增殖检测是评估细胞健康程度、遗传毒性及抗肿瘤药物效果的基础实验手段。检测细胞增殖最精确的方法是BrdU法。EdU法检测试剂盒是BrdU法的革命性突破。EdU（5-乙炔基-2’-脱氧尿苷）是一种嘧啶类似物，在DNA合成期整合入DNA双链。EdU法检测基于“点击”反应，一种由铜催化的叠氮化合物和炔烃作用发生共价反应，形成共价键。
本试剂盒中，EdU含有炔烃，YF^®488/555/594/647A Azide染料含有叠氮化合物。点击法的EdU标记增殖快速有效，易于使用。BrdU方法需要DNA变性（如酸变性、热变性或者用DNase消化）暴露出BrdU，从而方便BrdU抗体结合；而EdU法只需多聚甲醛固定和Triton X-100促渗就可以使检测试剂进入细胞，只需少量的叠氮化染料即可非常有效地标记出整合的EdU。
本试剂盒包含EdU法检测所需要的所有组分，可以用于体外培养细胞的增殖检测。

注意事项

1. 使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

2. 荧光染料均存在淬灭问题，实验操作时请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

3. Click-iT EdU缓冲液添加物溶液最好现配现用，以保证最佳结果。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

说明书：

C6044S/C6044M/C6044L
MSDS：
MSDS C6044 YF®555 Click-iT EdU Universal Cell Proliferation Detection Kit
常见问题解答：

◆YF®488/555/594/647有什么区别？

主要就是检测EDU的物质带的荧光基团不同，检测时发射荧光的颜色不同。实验效果相同，可根据偏好或需求进行选择。

◆EdU试剂盒中，固定后3% BSA in PBS的作用是什么？
清洗步骤中，BSA可以终止掉未反应的甲醛。

◆能否在活细胞中进行Click-iT EdU检测？
不可以。虽然EdU是对活细胞进行代谢标记，但是叠氮化物检测试剂和缓冲液组分是细胞非透过型，检测信号时的Click反应必须在固定和通透的样品上进行。

◆质粒转染表达的荧光蛋白检测与Click反应兼容吗？检测顺序是什么？
本产品会影响GFP、RFP、mCherry等荧光蛋白的荧光，故染色后无法直接检测GFP，建议使用GFP抗体间接检测。

◆观测到较高的本底干扰，这是什么原因所致？如何减少本底干扰？
叠氮化物和炔烃类间Click反应非常有选择性，生物体内几乎不可能有副反应发生，所以本底较高一般是由洗涤不充分造成的。减少本底干扰的最佳方法是增加BSA洗涤的次数。同时，也可在同样的检测条件下设置一组同等处理的无染料或无Click反应对照，以排除自发荧光干扰。此外，您还可在无EdU 体系中进行完整的Click反应，验证Click反应信号的特异性。

◆为什么标记样品无信号或特异性信号非常低？如何提高信号？
1.请保证试剂使用时为无色的状态，不要使用已经变黄的添加剂或缓冲液；
2.为确保Click反应试剂能够到达核内，细胞需要充分地固定和通透；
3.由于铜离子能结合到部分试剂上，这会导致催化Click反应的有效浓度降低。所以在Click反应前，不要在任何缓冲液或试剂中引入金属螯合剂（例如EDTA、EGTA、柠檬酸盐等），对某些含有这些物质的实验样品来说，进行Click反应前，可能需要增加额外的洗涤步骤；
4.当铜离子在合适的化合价时，Click反应才有效。Click反应中用到的铜离子为一价铜(Cu⁺)。
5.延长Click反应的时间至超过30分钟也并不会提高信号。建议使用新鲜的Click反应试剂再次进行30分钟的孵育，可更有效地提高标记效率。

◆如何对细胞核进行复染？
试剂盒中配有Hoechst 33342，可以在Click反应后用于细胞核的染色，也可选择使用DAPI。

◆可以用于检测植物细胞核内的DNA复制吗?
可以。EdU是小分子，可以穿透植物细胞的细胞壁。

YF®647A Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒（远红荧光）货号: C6046S/C6046M/C6046L 规格: 2-20T/10-100T/50-500T

YF^®647A Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒（远红荧光）

产品货号: C6046S/C6046M/C6046L

产品规格: 2-20T/10-100T/50-500T

目录价（元）:191/550/1100

推荐仪器：荧光显微镜、流式细胞仪

大包装询价

产品概述：

产品货号及规格：

货号	产品名称	规格
C6043S	YF^®488 Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒（绿色荧光）	2-20T
C6043M		10-100T
C6043L		50-500T
C6044S	YF^®555 Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒（橙红色荧光）	2-20T
C6044M		10-100T
C6044L		50-500T
C6045S	YF^®594 Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒（红色荧光）	2-20T
C6045M		10-100T
C6045L		50-500T
C6046S	YF^®647A Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒（远红荧光）	2-20T
C6046M		10-100T
C6046L		50-500T

产品内容：

规格组分	2-20T	10-100T	50-500T	开封后保存温度	稳定性
A. 10 mM EdU	40 µL	200 µL	1 mL	-20℃	开封后按指定温度保存可有效放置一年
B. YF^®488/555/594/647A Azide	10 µL	50 µL	250 µL	-20℃，避光
C. 10× Click-iT EdU反应缓冲液	200 µL	1 mL	5 mL	2-8℃
D. CuSO₄	100 µL	500 µL	2× 1.25 mL	2-8℃
E. Click-iT EdU缓冲液添加物	6 mg	30 mg	150 mg	2-8℃
F. Hoechst 33342	5 µL	25 µL	125 µL	2-8℃

荧光光谱数据：YF^®488 Azide：495/519 nm；YF^®555 Azide：555/565 nm；YF^®594 Azide：590/617 nm

YF^®647A Azide：650/670 nm；Hoechst 33342：350/461 nm（bound to DNA）

储存条件
-20℃避光保存，有效期见外包装。开封后，保存温度详见说明书。
产品介绍

注意事项

1. 使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

2. 荧光染料均存在淬灭问题，实验操作时请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

3. Click-iT EdU缓冲液添加物溶液最好现配现用，以保证最佳结果。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

说明书：

C6046S/C6046M/C6046L
MSDS：
MSDS C6046 YF®647A Click-iT EdU Universal Cell Proliferation Detection Kit
常见问题解答：

◆YF®488/555/594/647有什么区别？

主要就是检测EDU的物质带的荧光基团不同，检测时发射荧光的颜色不同。实验效果相同，可根据偏好或需求进行选择。

◆EdU试剂盒中，固定后3% BSA in PBS的作用是什么？
清洗步骤中，BSA可以终止掉未反应的甲醛。

◆如何对细胞核进行复染？
试剂盒中配有Hoechst 33342，可以在Click反应后用于细胞核的染色，也可选择使用DAPI。

◆可以用于检测植物细胞核内的DNA复制吗?
可以。EdU是小分子，可以穿透植物细胞的细胞壁。

Cell Cycle and Apoptosis Kit（细胞周期检测试剂盒）货号: C6031S/C6031L 规格: 50T/100T

Cell Cycle and Apoptosis Kit（细胞周期检测试剂盒）

产品货号: C6031S/C6031L

产品规格: 50T/100T

目录价（元）:350/600

推荐仪器：流式细胞仪

大包装询价

产品概述：

产品内容

组分	C6031S (50T)	C6031L (100T)
A. 染色缓冲液	25 mL	50 mL
B. 碘化丙啶染色液（20×）	1.25 mL	2 × 1.25 mL
C. RNase A（50×）	0.5 mL	1 mL

储存条件

-20ºC保存，有效期见外包装。组分B碘化丙啶染色液（20 ×）需避光保存。

产品介绍
细胞周期检测试剂盒（Cell Cycle and Apoptosis Kit）是一种采用经典的碘化丙啶（Propidium Iodide，即PI）染色方法进行细胞周期与细胞凋亡分析的检测试剂盒。
碘化丙啶是一种双链DNA的荧光染料。碘化丙啶和双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。
碘化丙啶染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及发生DNA片段化（DNA fragmentation）导致部分基因组DNA片段在染色过程中丢失，因此凋亡细胞碘化丙啶染色后呈现明显的弱染，即荧光强度小于1，在流式检测的荧光图上出现所谓的sub-G1峰，即凋亡细胞峰。
细胞发生凋亡时，由于胞浆和染色质浓缩、核碎裂，产生凋亡小体，使细胞的光散射性质发生变化。在细胞凋亡的早期，细胞对前向角光散射的能力显著降低，对侧向光散射的能力增加或没有变化。在细胞凋亡的晚期，前向和侧向光散射的信号均降低。因此可通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化观察细胞凋亡情况。
本试剂盒通常应用于培养的贴壁或悬浮细胞的细胞周期与细胞凋亡检测。如果用于组织的细胞周期与细胞凋亡检测，则必须把组织消化成单细胞状态，才可以进行检测。

注意事项
1. 荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
2. 碘化丙啶对人体有刺激性，请注意适当防护。
3. 碘化丙啶是已知的诱变剂，因此该溶液在丢弃之前需要先经过活性炭处理。
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

说明书：

C6031S/C6031L
MSDS：
MSDS C6031 Cell Cycle and Apoptosis Kit
使用本产品的文献：

1.DRP1 upregulation promotes pancreatic cancer growth and metastasis through increased aerobic glycolysis
Jing Liang，Yiping Yang，Lu Bai，Feng Li，Enxiao Li
J Gastroenterol Hepatol.

2.Molecular subtypes based on CNVs related gene signatures identify candidate prognostic biomarkers in lung adenocarcinoma
Baihui Li, Ziqi Huang, Wenwen Yu, Shaochuan Liu, Jian Zhang, Qingqing Wang, Lei Wu, Fan Kou, Lili Yang
Neoplasia Volume23,Issue 7,July 2021,Page 704-717

3.POZ/BTB and AT hook containing zinc finger 1 (PATZ1) suppresses differentiation and regulates metabolism in human embryonic stem cells

Cuihong Zhao , Min Yan , Chengjuan Li , Zhongtao Feng

International Journal of Biological Sciences

参考文献:
1.An Experimental Analysis of the Molecular Effects of Trastuzumab (Herceptin) and Fulvestrant (Falsodex), as Single Agents or in Combination, on Human HR+/HER2+ Breast Cancer Cell Lines and Mouse Tumor Xenografts
应用方向：周期检测：乳腺癌细胞系ZR-75-1 和 BT-474

2.Wnt/β-catenin signaling pathway inhibits the proliferation and apoptosis of U87 glioma cells via different mechanisms.
应用方向：周期检测：U87胶质瘤细胞

3.Treatment with a selenium-platinum compound induced T-cell acute lymphoblastic leukemia/lymphoma cells apoptosis through the mitochondrial signaling pathway
应用方向：周期检测：Jurkat和Molt-4细胞

4.Human cytomegalovirus miR-US5-1 inhibits viral replication by targeting Geminin mRNA
应用方向：周期检测：U373细胞

5.shRNA-Mediated EMMPRIN Silencing Inhibits Human Leukemic Monocyte Lymphoma U937 Cell Proliferation and Increases Chemosensitivity to Adriamycin.

应用方向：周期检测：U937细胞

YF®594 Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒（红色荧光）货号: C6045S/C6045M/C6045L 规格: 2-20T/10-100T/50-500T

YF^®594 Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒（红色荧光）

产品货号: C6045S/C6045M/C6045L

产品规格: 2-20T/10-100T/50-500T

目录价（元）:191/550/1100

推荐仪器：荧光显微镜、流式细胞仪

大包装询价

产品概述：

产品货号及规格：

货号	产品名称	规格
C6043S	YF^®488 Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒（绿色荧光）	2-20T
C6043M		10-100T
C6043L		50-500T
C6044S	YF^®555 Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒（橙红色荧光）	2-20T
C6044M		10-100T
C6044L		50-500T
C6045S	YF^®594 Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒（红色荧光）	2-20T
C6045M		10-100T
C6045L		50-500T
C6046S	YF^®647A Click-iT EdU 通用款细胞增殖检测试剂盒（远红荧光）	2-20T
C6046M		10-100T
C6046L		50-500T

产品内容：

规格组分	2-20T	10-100T	50-500T	开封后保存温度	稳定性
A. 10 mM EdU	40 µL	200 µL	1 mL	-20℃	开封后按指定温度保存可有效放置一年
B. YF^®488/555/594/647A Azide	10 µL	50 µL	250 µL	-20℃，避光
C. 10× Click-iT EdU反应缓冲液	200 µL	1 mL	5 mL	2-8℃
D. CuSO₄	100 µL	500 µL	2× 1.25 mL	2-8℃
E. Click-iT EdU缓冲液添加物	6 mg	30 mg	150 mg	2-8℃
F. Hoechst 33342	5 µL	25 µL	125 µL	2-8℃

荧光光谱数据：YF^®488 Azide：495/519 nm；YF^®555 Azide：555/565 nm；YF^®594 Azide：590/617 nm

YF^®647A Azide：650/670 nm；Hoechst 33342：350/461 nm（bound to DNA）

储存条件
-20℃避光保存，有效期见外包装。开封后，保存温度详见说明书。
产品介绍

注意事项

1. 使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

2. 荧光染料均存在淬灭问题，实验操作时请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

3. Click-iT EdU缓冲液添加物溶液最好现配现用，以保证最佳结果。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
说明书：

C6045S/C6045M/C6045L
MSDS：
MSDS C6045 YF®594 Click-iT EdU Universal Cell Proliferation Detection Kit
常见问题解答：

◆YF®488/555/594/647有什么区别？

主要就是检测EDU的物质带的荧光基团不同，检测时发射荧光的颜色不同。实验效果相同，可根据偏好或需求进行选择。

◆EdU试剂盒中，固定后3% BSA in PBS的作用是什么？
清洗步骤中，BSA可以终止掉未反应的甲醛。

◆如何对细胞核进行复染？
试剂盒中配有Hoechst 33342，可以在Click反应后用于细胞核的染色，也可选择使用DAPI。

◆可以用于检测植物细胞核内的DNA复制吗?
可以。EdU是小分子，可以穿透植物细胞的细胞壁。

YF®488-Annexin V/RedNucleus Ⅱ 细胞凋亡试剂盒货号: Y6102S/Y6102M/Y6102L 规格: 10T/50T/100T

YF^®488-Annexin V/RedNucleus Ⅱ 细胞凋亡试剂盒

产品货号: Y6102S/Y6102M/Y6102L

产品规格: 10T/50T/100T

目录价（元）:317/1194/1769

推荐仪器：流式细胞仪（主推）、荧光显微镜

大包装询价

产品概述：

产品内容：

组分	Y6102S (10T)	Y6102M（50T）	Y6102L (100T)
A. 1× Annexin V 结合缓冲液	10 mL	50 mL	50 mL×2
B. YF^®488-Annexin V	50 μL	250 μL	500 μL
C. RedNucleus II	100 μL	500 μL	1 mL

储存条件

4℃避光冷藏，请勿冻存。有效期见外包装。

光谱特性

YF^®488-Annexin V：Ex/Em=490/515 nm

RedNucleus II：Ex/Em=635/695 nm

产品介绍

Annexin V（膜联蛋白-V）是一种分子量为 35-36 KD的 Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，可与磷脂酰丝氨酸（PS）选择性结合。磷脂酰丝氨酸（PS）主要分布在细胞膜内侧，即与细胞浆相邻的一侧。在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把磷脂酰丝氨酸外翻到细胞表面，暴露在细胞外环境中。此时，使用绿色荧光探针 YF^®488的 Annexin V, 即 YF^®488-Annexin V，与外翻的磷脂酰丝氨酸（PS）结合，就可用流式细胞仪直接检测到磷脂酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。正常细胞不会被 YF^®488-Annexin V所染色，发生凋亡或坏死的细胞会被 YF^®488-Annexin V 所染色。YF^®488-Annexin V可以与部分非渗透性的细胞核染料（7-AAD/PI）等联合使用，区分处于不同凋亡时期的细胞。

本试剂盒中提供的 RedNucleus II 是一种远红光染料，属于蒽醌类化合物，不能透过活细胞和早期凋亡细胞完整的细胞膜，是非渗透性的，但是可以快速染色死亡和透化细胞中的细胞核/dsDNA。RedNucleus II 是一种理想的碘化丙啶（PI）和 7-AAD 的替代物。YF^®488 与 RedNucleus II 之间光谱无交叉。与 YF^®488-Annexin V 联用，对于无自发荧光、自带 RFP 或阿霉素诱导凋亡的细胞，都无需补偿调节。

注意事项

1. 使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

2. 为降低细胞凋亡进程，孵育过程可在冰上操作，但孵育时间至少延长至30 min。

3. 由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后 1 h之内进行分析。

4. 对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，RedNucleus II 摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与 YF^®488-Annexin V的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇时胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用 EDTA，EDTA 会影响 Annexin V 与 PS 的结合。

5. 贴壁细胞用胰蛋白酶消化后，建议在最佳培养条件和培养基中恢复约30 min后染色，避免假阳性。

6. 为了避免洗涤细胞时损失细胞，在吸液时可以用大的 Tip 头套上小的 Tip 头吸液。

7. 染料的最佳使用浓度由具体实验要求确定。

8. 荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

9. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

说明书：

Y6102S/Y6102M/Y6102L
MSDS：
MSDS Y6102 YF®488-Annexin V and RedNucleus Ⅱ Apoptosis Kit
常见问题解答：

◆为何染色结果显示细胞凋亡率过高？

1. 凋亡时间处理过长，使细胞全部死亡。建议重新摸索细胞凋亡条件，使细胞处于不同的凋亡状态。
2. 对于贴壁细胞，胰蛋白酶消化时间过长或机械刮擦细胞会暂时破坏质膜，使Annexin V能够与细胞膜胞内面上的磷脂酰丝氨酸结合，导致假阳性染色。建议在胰蛋白酶消化或机械刮擦细胞后，让细胞在最佳细胞培养条件和培养基中培养约30分钟，以恢复其膜完整性。

◆实验结果使用什么仪器观察？
实验结果可以通过流式细胞仪和荧光显微镜进行观察，但更推荐使用流式细胞仪。因为正常的细胞和凋亡的细胞膜上都有磷脂酰丝氨酸（PS），只是凋亡细胞膜外更多，可以结合更多的Annexin V，流式细胞仪更灵敏，可以区分出微小差异，将正常细胞与凋亡细胞分成不同的两群，但如果用荧光显微镜，可能观察不到这一差别，尤其是贴壁细胞。若要在成像测定中检测细胞凋亡，推荐使用SuperView™ 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells。

◆流式细胞仪检测细胞凋亡，结果图中的各个象限代表什么状态的细胞？
左上角：Annexin V-/PI+，机械损伤细胞；右上角: AnnexinV+/PI+，晚期凋亡细胞或坏死；右下角：AnnexinV+/PI-，早期凋亡细胞；左下角：AnnexinV-/PI-，正常细胞。

◆这款试剂盒可同时检测出凋亡率和细胞周期分布吗？
不可以。检测细胞凋亡时PI结合的是核酸，包括DNA和RNA。而PI用于检测细胞周期时需要只结合DNA，由于RNA的干扰，用细胞凋亡检测试剂盒测出来的细胞周期不准。同时，凋亡检测与周期检测时PI的工作浓度以及样本处理都不一样。如果需要进行细胞周期检测，推荐Cell Cycle and Apoptosis Kit（C6031）

◆各象限代表的细胞状态问题？
Q1：(AnnexinV-染料)-/PI+，此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期凋亡细胞在其中，甚至机械损伤的细胞也包含其中。Annexin V-/PI+越多，实验结果越不可信，建议实验中尽量控制这一象限细胞比例。
Q2: (AnnexinV+染料)+/PI+，此区域的细胞为晚期凋亡细胞或坏死。
Q3：(AnnexinV-染料)+/PI-，此区域的细胞为早期凋亡细胞。
Q4：(AnnexinV-染料)-/PI-，此区域的细胞为活细胞。

YF®488-Annexin V/RedNucleus Ⅱ 细胞凋亡试剂盒货号: Y6102S/Y6102M/Y6102L 规格: 10T/50T/100T

◆假阳性问题？

1. 消化液中含有EDTA或消化时间过长引起的假阳性。Annexin V和PS的结合需要Ca2+，而EDTA是Ca2+螯合剂，使用含有EDTA的胰酶会造成假阴性。其次消化时间不宜过长，吹打细胞要轻柔，因为胰酶的过度消化和机械损伤都会引起细胞膜的损伤，造成假阳性。细胞消化下来后，建议在培养箱中在孵育30min，使细胞膜恢复完整性，避免假阳性，或者将细胞报讯在含2% BSA的PBS中，防止进一步的损伤。
2. 如果样品来源于血液，必须去除血液中的血小板，因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，干扰实验结果。建议：可以含有EDTA的缓冲液200g离心去除血小板，最后细胞多洗几遍，减小EDTA螯合钙离子产生的影响。
3. 神经细胞膜容易破坏外翻，导致假阳性，所以Annexin V/PI 双染法流式检测细胞凋亡不适用于神经细胞。
4. 诱导时间过长。一般情况下诱导几个小时就可以出现早期凋亡，因此通常不需要处理大于48小时以上，诱导时间过长会使营养物质耗尽，导致细胞状态差，假阳性结果偏高。

◆荧光染料选择的问题？
1. 实验样本是否带荧光，因为感染病毒或质粒转染的细胞往往带GFP荧光，GFP与YF488/FITC通道重叠，不能选择YF488/FITC标记的Annexin V，此时如果只有488 nm一根激光管可以用PE标记Annexin V，用7-AAD代替PI，若有633 nm激光管，可以改用YF647 Annexin V代替YF488。
2. 如果流式细胞仪带有488 nm和633 nm两个或以上激光管，首先考虑用APC或YF647标记 Annexin V，因为它和PI通道几乎不用考虑光重叠问题，可以减少调节补偿的烦恼，如果只有488 nm激光管则可选择YF488/FITC标记的Annexin V。
3. 处理因素是否带有荧光，本实验室就碰到过一个促凋亡药物Doxorubicin本身发红色荧光，对PI通道的检测造成严重干扰，而且浓度越大干扰越明显。这时建议选用A6079或Y6102 。

◆圈门问题？
1.要特别注意在FSC/SSC圈门时，所选细胞范围会对结果造成较大影响，所以在分析数据时，要把所有细胞都圈进FSC/SSC的门内，这样实验结果才会更可信。如图，使细胞群大概位于对角线上，并且细胞群较集中，群内细胞比例要在80%以上，如果细胞全部圈入，细胞比例才50%或者更低，说明细胞被压在了坐标轴上，这时要重新调节FSC和SSC。
2.贴壁细胞做Annexin V凋亡检测，通常分群不太规则，这时我们可以根据不加药细胞来画不规则的十字门。如上面图形的设门方式：

◆免疫染色与凋亡染色顺序问题?
Annexin V凋亡染色可以和抗体一起对细胞进行染色吗？
可以，但建议Annexin V和其它抗体分开染色。例如Annexin V、PI和CD3、CD8同时标记淋巴细胞，可以先在PBS中标记CD3/CD8后洗去，再在Binding buffer（含钙离子）中标记Annexin V。

◆这款试剂盒可同时检测出凋亡率和细胞周期分布吗？
不可以。检测细胞凋亡时PI结合的是核酸，包括DNA和RNA。而PI用于检测细胞周期时需要只结合DNA，由于RNA的干扰，用细胞凋亡检测试剂盒测出来的细胞周期不准。同时，凋亡检测与周期检测时PI的工作浓度以及样本处理都不一样。若果需要进行细胞周期检测，推荐Cell Cycle and Apoptosis Kit（C6031）

◆固定、冷冻、切片或解离的组织，还可以做流式细胞分析吗？
不建议做流式细胞分析。因为流式细胞分析要求细胞分散、单个，活性好，这些状态下的样本外膜上的PS及膜的完整性都受到了影响，因此无法依赖膜的完整性区分健康细胞和凋亡细胞。组织在冻存、复温的过程中会有大量的细胞死亡，同时经过这一过程的组织在分离成单个细胞的时候会形成许多细胞碎片，不宜上流式检测，所以用于流式检测的标本最好是新鲜标本，即取材后立即检测，效果最好。液氮保存的◆组织块，可以将组织标本进行切片，然后做原位染色，观察组织细胞的凋亡。

◆Annexin V可以用在植物和细菌中吗？
Annexin V也可以用在植物和细菌中检测凋亡，具体实验步骤可参考相关文献。